Virologisk diagnostikk: metoder og tolkning

Sammendrag

Virologisk diagnostikk bygger på tre spørsmål: hva skal påvises, i hvilken prøve og på hvilket tidspunkt? Nukleinsyrepåvisning med PCR eller annen nukleinsyreamplifisering er førstevalgsmetode ved de fleste akutte virusinfeksjoner. Antigentest gir raskere svar, men har vanligvis lavere følsomhet. Serologi påviser vertens immunrespons og brukes først og fremst ved gjennomgått infeksjon, immunitetsvurdering eller infeksjoner der viremien er kortvarig. Virusdyrkning, mikroskopi, immunhistokjemi, in situ-hybridisering og sekvensering har mer spesialiserte indikasjoner.

Et laboratorieresultat er ikke det samme som sykdom. Et positivt PCR-resultat viser at viralt genom finnes i prøven, men innebærer ikke nødvendigvis aktiv replikasjon, smittsomhet eller at viruset forårsaker pasientens symptomer. Et negativt resultat utelukker ikke infeksjon hvis prøven er tatt fra feil anatomisk lokalisasjon, for tidlig eller for sent, med utilstrekkelig prøvemengde eller etter mangelfull transport. Ct-verdier fra kvalitative PCR-metoder skal ikke sammenlignes mellom analyseplattformer og bør ikke alene styre vurdering av smittsomhet eller behandling.

All tolkning skal integrere sannsynligheten før prøvetaking, sykdomsfase, immunstatus, vaksinasjoner, tidligere infeksjoner, prøvemateriale, metodens validerte bruksområde og mulige kryssreaksjoner. Ved et uventet resultat bør man i første rekke gjennomgå disse faktorene, rådføre seg med klinisk mikrobiolog og ved behov ta en ny prøve eller bruke en metode som påviser en annen biologisk markør.

Kliniske problemstillinger

Virologisk diagnostikk brukes til flere ulike formål:

• fastslå årsaken til et akutt klinisk syndrom
• avgjøre om en infeksjon er aktuell, tidligere gjennomgått eller latent
• vurdere effekten av antiviral behandling
• følge virusreplikasjon hos immunsupprimerte pasienter
• identifisere antiviral resistens
• vurdere smittsomhet eller behov for smitteverntiltak
• fastslå immunitet etter infeksjon eller vaksinasjon
• diagnostisere kongenital infeksjon
• type virus for prognose, smittesporing eller epidemiologisk overvåking

Samme analyse kan ikke besvare alle disse spørsmålene. En positiv antistofftest kan for eksempel støtte tidligere eksponering, men sier sjelden noe om hvorvidt viruset finnes i luftveiene samme dag. En kvalitativ PCR kan bekrefte at nukleinsyre er påvist, men er ikke automatisk en validert kvantitativ virusmåling.

Diagnostisk strategi

Gå ut fra syndrom, lokalisasjon og sykdomsfase

Prøvetakingen bør rettes mot den anatomiske lokalisasjonen der viruset sannsynligvis replikerer på det aktuelle tidspunktet. Ved luftveisinfeksjon brukes som regel en prøve fra øvre luftveier tidlig i forløpet. Ved alvorlig pneumoni og negativ prøve fra øvre luftveier kan prøve fra nedre luftveier være mer relevant. Ved encefalitt analyseres spinalvæske, men blod, serum, luftveisprøve, feces eller vev kan måtte supplere avhengig av mistenkt virus. Forskjellen mellom analytisk følsomhet og klinisk følsomhet er sentral: selv en svært følsom analyse blir klinisk utilstrekkelig hvis prøvematerialet ikke inneholder virus [1].

Prøvetakingsteknikken har målbar betydning. I en systematisk oversikt over 106 studier og drøyt 60 000 parede prøver var vanlige spyttprøver og nasale prøver i snitt 12 prosentpoeng mindre følsomme enn nasofarynksprøver ved SARS-CoV-2-RT-PCR. Orofarynksprøver var 17 prosentpoeng mindre følsomme. Derimot hadde gurgleprøver og spytt etter harking sammenlignbar følsomhet, men evidensen hadde betydelige metodologiske begrensninger [2]. Resultatene kan ikke overføres direkte til alle luftveisvirus, men illustrerer at metode, prøvelokalisasjon og prøvetakingsteknikk må betraktes som en sammenhengende diagnostisk kjede.

Tidspunktet avgjør hvilken biologisk markør som er mest informativ. Nukleinsyre og antigen kan vanligvis påvises tidlig, mens spesifikke antistoffer utvikles senere. Etter den akutte fasen kan nukleinsyre vedvare selv om dyrkbart virus ikke lenger kan påvises. Hos immunsupprimerte pasienter kan både viruskinetikk og antistoffrespons avvike kraftig fra det forventede [3].

flowchart TD
A["Definer spørsmålet<br>aktuell infeksjon, immunitet<br>eller oppfølging"] --> B["Velg anatomisk lokalisasjon<br>og prøvemateriale"]
B --> C["Vurder tid fra eksponering<br>og symptomdebut"]
C --> D["Mistenkt akutt infeksjon"]
C --> E["Sen eller gjennomgått infeksjon"]
C --> F["Monitorering eller resistens"]
D --> G["PCR eller annen NAAT<br>eventuelt antigentest"]
E --> H["Serologi<br>eventuelt PCR som supplement"]
F --> I["Kvantitativ NAAT<br>eller sekvensering"]
G --> J["Tolk mot klinikk<br>prøvekvalitet og sannsynlighet"]
H --> J
I --> J
J --> K["Uventet eller inkongruent svar"]
K --> L["Rådfør deg med laboratoriet<br>ny prøve eller alternativ metode"]

Når skal prøven tas om igjen?

Gjentatt prøvetaking er berettiget når:

• sannsynligheten for infeksjon er høy til tross for negativ prøve
• den første prøven kan ha blitt tatt før virusmengden ble påvisbar
• prøvemateriale eller prøvetakingsteknikk har vært suboptimale
• infeksjonen kan ha flyttet seg fra øvre til nedre luftveier
• et serologisk vindu mistenkes
• et svakt positivt eller grensenært resultat ikke stemmer med klinikken
• serokonversjon eller titerstigning må dokumenteres
• en kvantitativ trend skal bekreftes før behandlingen endres

En ny prøve bør om mulig tas fra den mest relevante lokalisasjonen og ikke bare gjenta samme feilkilde.

Prøvemateriale og preanalyse

Prøvetaking

Prøvetakingsveiledningen for den spesifikke analysen skal følges. Et materiale som fungerer for PCR, behøver ikke være validert for antigenpåvisning, dyrkning eller sekvensering. Kontroller særlig:

• type prøvepinne og transportmedium
• minste prøvevolum
• om prøven skal kjølelagres
• tillatt transporttid
• om prøven kan fryses
• om formalinfiksert materiale godtas
• om fullblod, plasma og serum kan brukes om hverandre
• om testen krever celler, fritt virus eller begge

Utilstrekkelig celleinnhold i en slimhinneprøve kan gi falskt negativt resultat. Intern kontroll i en molekylær analyse kan vise at ekstraksjon og amplifisering har fungert, men beviser ikke alltid at prøven er tatt fra riktig anatomisk lokalisasjon.

Virusdyrkning krever som regel raskere transport og bedre bevart virusviabilitet enn PCR. HSV er følsomt for uttørking, temperatur og pH. PCR har høyere følsomhet og er mindre avhengig av opprettholdt viabilitet, men også nukleinsyre kan brytes ned ved uegnet lagring [4].

Valg av prøve ved vanlige syndromer

Biosikkerhet og kontakt med laboratoriet

Ved mistanke om høypatogent, uvanlig eller meldepliktig virus skal laboratoriet kontaktes før prøvetaking og transport. Det gjelder blant annet mistenkte hemoragiske febersykdommer, visse zoonoser og agens som krever særskilt inneslutning. Laboratoriet avgjør egnet prøvemateriale, emballasje, transportvei og hvilke analyser som kan gjøres trygt. Svensk håndtering styres av svenske nasjonale smittevernregler og lokale laboratorieveiledninger, som kan avvike fra internasjonale publikasjoner.

Direkte påvisningsmetoder

Nukleinsyreamplifisering

NAAT omfatter PCR, RT-PCR for RNA-virus og andre amplifiseringsmetoder. Sanntids-PCR er vanligst. Amplifiseringen følges kontinuerlig med fluorescens og kan rapporteres kvalitativt eller kvantitativt.

Fordeler:

• høy analytisk følsomhet og spesifisitet
• raskere svar enn dyrkning
• mulighet for multipleksanalyse
• mulighet for typing og kvantifisering
• krever ikke levende virus

Begrensninger:

• påviser nukleinsyre, ikke nødvendigvis replikasjonskompetent virus
• følsom for kontaminasjon og prøveforveksling
• sekvensvariasjon kan påvirke primer eller probe og gi falskt negativt resultat
• inhibitorer kan hemme ekstraksjon eller amplifisering
• svært høy følsomhet kan påvise klinisk irrelevant utskillelse
• et negativt resultat begrenses av prøvelokalisasjon og tidspunkt

Flere genetiske mål reduserer sårbarheten for mutasjoner og gir støtte ved uventede resultater. Ved et resultat der bare ett av flere mål påvises, bør laboratoriets tolkningsalgoritme følges. Det kan dreie seg om lav virusmengde, genetisk variasjon, uspesifikt signal eller kontaminasjon.

Andre nukleinsyreamplifiserende teknikker omfatter blant annet TMA og LAMP. I en Cochrane-oversikt over alternative molekylære metoder for SARS-CoV-2 hadde TMA en samlet følsomhet på 97,6 prosent og spesifisitet på 99,4 prosent. RT-LAMP hadde henholdsvis 88,4 og 99,7 prosent, mens RT-LAMP uten konvensjonell RNA-ekstraksjon hadde lavere følsomhet, 73,1 prosent. Resultatene varierte mellom fabrikater, og mange studier hadde høy risiko for systematiske feil [5]. Metodenavnet er derfor ikke tilstrekkelig for å vurdere ytelsen til en test.

Multipleks-PCR

Multiplekspaneler analyserer flere virus, iblant også bakterier, samtidig. De er særlig nyttige når symptombildet er uspesifikt og et raskt etiologisk svar påvirker isolering, antiviral behandling eller antibiotikabruk.

Begrensninger:

• panelet påviser bare de inkluderte målene
• flere mål øker sannsynligheten for uventede bifunn
• samtidig påvisning av flere agens beviser ikke at samtlige bidrar til sykdommen
• vedvarende nukleinsyre kan feiltolkes som aktuell infeksjon
• negative resultater kan skape falsk trygghet for agens som ikke inngår

For influensa har antigenmetoder og direkte immunfluorescens historisk hatt lavere følsomhet enn RT-PCR, mens dyrkning tar for lang tid for de fleste akutte behandlingsbeslutninger [6]. For humant metapneumovirus er PCR mer følsom enn dyrkning og immunfluorescens, og virusets langsomme vekst gjør dyrkning uegnet for rutinemessig akuttdiagnostikk [7]. Disse erfaringene har bidratt til at multipleks-NAAT er blitt standard ved mange luftveissyndromer.

Kvantitativ PCR og virusmengde

Kvantitative analyser rapporteres vanligvis som IU/ml eller kopier/ml. De brukes først og fremst for:

• HIV-RNA
• HBV-DNA
• HCV-RNA
• CMV-DNA
• EBV-DNA i utvalgte situasjoner
• BK-polyomavirus-DNA etter transplantasjon

Kvantifisering krever en validert kalibrering og et definert lineært måleområde. Resultater under kvantifiseringsgrensen kan være påvist, men ikke pålitelig målbare. Små variasjoner skal ikke overtolkes. For HCV kan endringer mindre enn 0,5 log10 IU/ml tilsvare analytisk variasjon snarere enn reell biologisk endring [8].

Ved monitorering bør samme prøvetype, analyseplattform og laboratorium brukes når det er mulig. Fullblod og plasma kan gi ulike nivåer og kan ikke automatisk brukes om hverandre. Et enkeltstående nivå bør tolkes sammen med trend, behandling, immunstatus og organpåvirkning.

Ct-verdi

Ct er det antallet amplifiseringssykluser som kreves før fluorescenssignalet passerer analysens terskel. En lavere Ct-verdi tilsvarer vanligvis mer målnukleinsyre i den analyserte prøven. Ct er imidlertid ikke et direkte og universelt mål på virusmengde.

Ct påvirkes av:

• prøvemengde og prøvetakingsteknikk
• anatomisk prøvelokalisasjon
• tidspunkt i sykdomsforløpet
• transport og lagring
• ekstraksjonsmetode
• prøvevolum som tilføres reaksjonen
• målgen, primer og probe
• instrument, reagenser og terskelinnstilling
• forekomst av inhibitorer
• om resultatet er normalisert mot cellemengde

Kvalitative PCR-metoder er validert for påvist eller ikke påvist, ikke for kvantitativ sammenligning. Ct-verdier fra ulike plattformer eller ulike målgener kan derfor ikke sammenlignes direkte. En høy Ct-verdi kan tilsvare lav virusmengde, men også prøvetaking sent i forløpet, nedbrutt materiale eller signal nær analysens deteksjonsgrense. En lav Ct-verdi taler for mer nukleinsyre, men beviser ikke alene smittsomhet eller sykdomsgrad [9].

Antigenpåvisning

Antigentest påviser virale proteiner med for eksempel lateralstrømsteknikk, enzymimmunanalyse eller kjemiluminescens. De gir ofte svar innen 10 til 30 minutter og kan brukes nær pasienten.

Antigentester fungerer best når virusmengden er høy. De har som regel høy spesifisitet, men lavere følsomhet enn NAAT. I en metaanalyse av SARS-CoV-2-tester nær pasienten var den samlede følsomheten 70,6 prosent og spesifisiteten 98,9 prosent for antigentest. Tilsvarende resultater for molekylære hurtigtester var henholdsvis 92,8 og 97,6 prosent [10]. Følsomheten til antigentestene sank tydelig hos asymptomatiske personer og etter den første sykdomsuken.

En positiv antigentest ved typiske symptomer og høy prevalens har ofte høy positiv prediktiv verdi. En negativ test utelukker derimot ikke infeksjon ved sterk klinisk mistanke. IDSAs retningslinje for SARS-CoV-2 angir at de fleste positive antigentester kan brukes uten molekylær bekreftelse, mens en negativ test ved fortsatt mistanke bør følges av NAAT eller gjentatt antigentesting [11]. Prinsippet er relevant også for andre antigenbaserte hurtigtester, men den eksakte algoritmen må følge valideringen av den aktuelle testen.

Virusdyrkning

Ved virusdyrkning inokuleres prøven i mottakelige celler og vurderes med cytopatisk effekt, antigenfarging eller molekylær konfirmasjon. Dyrkning viser at replikasjonskompetent virus fantes i den undersøkte prøven, men et negativt dyrkningsresultat utelukker ikke viabelt virus, siden metoden har begrenset følsomhet.

Rutinemessig dyrkning er erstattet av NAAT for mange virus. Den brukes fortsatt ved:

• fenotypisk resistensbestemmelse
• karakterisering av nye eller uvanlige virus
• referansediagnostikk
• forskning og epidemiologisk overvåking
• særskilte problemstillinger om replikasjonskompetanse

Ved genital HSV er PCR betydelig mer følsom enn dyrkning. Dyrkningsfølsomheten avtar fra ferske vesikler til tilhelende eller skorpedekte lesjoner, og negativ dyrkning utelukker derfor ikke HSV [4].

Immunfluorescens

Direkte eller indirekte immunfluorescens påviser viralt antigen i celler. Metoden kan gi raskt svar og samtidig vise om prøven inneholder tilstrekkelig med epitelceller. Den krever en erfaren bedømmer og er vanligvis mindre følsom enn PCR. Den har nå først og fremst en supplerende rolle eller brukes der molekylær diagnostikk mangler.

Elektronmikroskopi

Elektronmikroskopi kan visualisere viruslignende partikler, men har lav følsomhet, krever høy viruskonsentrasjon og er vanskelig å tolke. Celleorganeller kan feilaktig tolkes som virus. Metoden anbefales ikke som rutinemessig primærdiagnostikk og bør forbeholdes ekspertlaboratorier [12].

Indirekte diagnostikk med serologi

Prinsipper

Serologi påviser spesifikke antistoffer, oftest IgM, IgG, totalantistoffer eller funksjonelt nøytraliserende antistoffer. Resultatet påvirkes av tid fra infeksjon, tidligere eksponeringer, vaksinasjon, immunstatus og testens antigenmål.

IgM skal tolkes forsiktig

IgM er ikke en universell markør for akutt primærinfeksjon. Falskt positiv IgM kan skyldes kryssreaktive antistoffer, revmatoid faktor, heterofile antistoffer eller polyklonal B-celleaktivering. Ved HSV kan IgM forekomme både ved primærinfeksjon og reaktivering og anbefales derfor ikke for rutinemessig klassifisering av genital herpes [4].

I en studie av fire serologiske analyser for SARS-CoV-2 hadde IgM- eller IgA-baserte tester lavere spesifisitet enn IgG-tester. Falskt positive resultater ble særlig sett i serum fra pasienter med serologiske tegn på Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia psittaci eller Legionella pneumophila [13]. Et uventet isolert IgM-resultat bør derfor bekreftes med ny prøve, alternativ analyse eller direkte viruspåvisning.

Serokonversjon, titerstigning og aviditet

Serokonversjon mellom akuttprøve og konvalesensprøve er sterkere evidens for nylig infeksjon enn en enkeltstående positiv prøve. Prøveintervallet må tilpasses virusets antistoffkinetikk, ofte omkring to til fire uker.

IgG-aviditet beskriver hvor sterkt antistoffene binder antigen. Lav aviditet kan støtte nylig primærinfeksjon, mens høy aviditet taler for at infeksjonen ligger lenger tilbake. Metoden er nyttig i særskilte problemstillinger, for eksempel ved uklar EBV-serologi eller vurdering av primærinfeksjon under graviditet. Resultatet må tolkes med analysespesifikke grenser.

Ved EBV taler kombinasjonen VCA-IgM positiv, VCA-IgG positiv og EBNA-1-IgG negativ vanligvis for primærinfeksjon. VCA-IgG sammen med EBNA-1-IgG uten VCA-IgM taler for tidligere infeksjon. Isolerte markører eller samtidig positivitet for alle tre kan kreve aviditet, immunoblot, oppfølgingsprøve eller EBV-DNA [14].

Kryssreaksjoner

Kryssreaksjon er særlig betydningsfull mellom nært beslektede virus. Flavivirusserologi kan påvirkes av tidligere dengue, zikavirus, TBE-virus, gulfeber eller vaksinasjon mot flavivirus. I de første sykdomsdagene bør molekylær diagnostikk prioriteres når viremi kan forventes. Senere brukes serologi, iblant med nøytralisasjonstest som bekreftelse [15].

Ved arbovirusencefalitt er viremien ofte kort, og serologi er derfor vanligere enn PCR. En positiv førstelinjetest kan måtte bekreftes med nøytralisasjon, serokonversjon eller minst firedobbel titerstigning i parede serumprøver [16].

Tolkning av vanlige resultatmønstre

Positiv PCR

Et positivt PCR-resultat kan innebære:

• akutt symptomgivende infeksjon
• presymptomatisk eller asymptomatisk infeksjon
• langvarig utskillelse etter gjennomgått infeksjon
• latent eller intermitterende reaktivert infeksjon
• kontaminasjon
• klinisk irrelevant bifunn

Sannsynligheten for kausalitet øker hvis funnet kommer fra riktig anatomisk lokalisasjon, sammenfaller tidsmessig med sykdommen, forekommer i relevant mengde og passer med syndromet. Kausaliteten er svakere for virus som ofte persisterer eller skilles ut asymptomatisk.

For EBV er blod-PCR nyttig for monitorering i visse transplantasjonssammenhenger, men et positivt resultat i blod eller spinalvæske beviser ikke alene EBV-forårsaket organsykdom. Ved EBV-assosiert tumor er påvisning av EBER i tumorceller med in situ-hybridisering mer direkte koblet til vevsdiagnosen [17].

Negativ PCR

Kontroller:

1. Var riktig prøvemateriale valgt?
2. Ble prøven tatt i riktig sykdomsfase?
3. Var prøvemengden tilstrekkelig?
4. Fungerte den interne kontrollen?
5. Kan sekvensvariasjon ha påvirket analysen?
6. Har antiviral behandling redusert virusmengden?
7. Trengs det en annen lokalisasjon eller indirekte diagnostikk?

Ved mistenkt HSV-encefalitt er PCR i spinalvæske førstevalgsmetode. En tidlig negativ prøve kan måtte gjentas ved vedvarende sterk mistanke. Intratekal antistoffanalyse kan være et senere supplement. Positiv PCR for lymfotrope herpesvirus i spinalvæske krever særlig forsiktig kausalitetstolkning [18].

Diagnostikk av virusinfeksjon i sentralnervesystemet vanskeliggjøres av at viruskonsentrasjonen kan være lav i spinalvæske, og av at det mest infiserte vevet ikke er tilgjengelig for prøvetaking [19].

Positiv serologi men negativ PCR

Dette kan tale for:

• gjennomgått infeksjon
• sen sykdomsfase etter avsluttet viremi
• vaksinasjon
• falskt positiv serologi
• prøvetaking fra feil lokalisasjon for PCR
• infeksjon der serologi er mer følsom enn direktepåvisning på det aktuelle tidspunktet

Positiv PCR men negativ serologi

Dette kan tale for:

• svært tidlig infeksjon før serokonversjon
• manglende antistoffrespons ved immunsuppresjon
• raskt igangsatt antiviral behandling
• uspesifikt eller kontaminert PCR-resultat
• vedvarende nukleinsyre hos en pasient hvis antistoffer ikke måles av den valgte analysen

Særskilte diagnostiske situasjoner

Viral hepatitt

Hepatittvirus illustrerer behovet for kombinert direkte og indirekte diagnostikk. Ved HCV brukes anti-HCV som eksponeringsmarkør og HCV-RNA for å fastslå aktuell infeksjon. Antistoffer kan drøye 34 til 70 dager hos immunkompetente og enda lenger ved HIV. Ved mistenkt akutt HCV bør derfor HCV-RNA analyseres selv om anti-HCV er negativ [8].

Ved HBV bør grunnprofilen omfatte HBsAg, total anti-HBc og anti-HBs. HBsAg taler for aktuell infeksjon, anti-HBc viser naturlig eksponering og anti-HBs kan skyldes vaksinasjon eller gjennomgått infeksjon. Vaksinasjon gir anti-HBs, men ikke anti-HBc. Isolert anti-HBc kan tilsvare utleget infeksjon med synkende anti-HBs, vindusfase, okkult infeksjon eller falsk reaktivitet. HBV-DNA er nødvendig ved uklar profil, immunsuppresjon og behandlingsmonitorering [8].

Før betydelig immunsuppresjon er det ikke tilstrekkelig å spørre etter kjent hepatitt. HBsAg og anti-HBc bør analyseres, siden også utleget HBV kan reaktiveres. HBV-DNA brukes til risikovurdering og oppfølging [20].

HIV

Moderne HIV-screening bruker kombinert antigen- og antistoffanalyse. En reaktiv screeningprøve skal alltid verifiseres etter laboratoriets konfirmasjonsalgoritme. Ved mistenkt svært tidlig infeksjon, diskrepante konfirmasjonsresultater eller påvirkning av preeksponeringsprofylakse kan HIV-RNA være nødvendig [21]. Fjerde generasjons tester kan forkorte det diagnostiske vinduet til omkring 14 dager, men en negativ tidlig prøve må relateres til siste eksponering og følges opp når det er indisert [22].

Kongenital CMV

Kongenital CMV diagnostiseres ved CMV-DNA i spytt eller urin innen de første 21 levedøgnene. Etter dette tidspunktet kan postnatal infeksjon ikke sikkert skilles fra kongenital infeksjon [23]. En positiv spyttprøve bør vurderes etter lokal konfirmasjonsrutine, siden kontaminasjon med maternelt virus kan forekomme. Serologi hos det nyfødte barnet er ikke tilstrekkelig for diagnose, siden maternelt IgG passerer placenta.

Immunsuppresjon og transplantasjon

Hos immunsupprimerte pasienter er en negativ antistofftest mindre pålitelig, og reaktivering av latente virus er vanligere. Kvantitativ NAAT brukes for å følge CMV, EBV og BK-polyomavirus, men terskler er metodeavhengige.

For BK-polyomavirus etter nyretransplantasjon er plasma-DNA bedre koblet til nefropatirisikoen enn virus i urin. En verdi over 10 000 kopier/ml har vært brukt som støtte for presumtiv BK-virusnefropati, men internasjonal analysestandardisering er utilstrekkelig. Histologi er fortsatt referansemetode, og sykdommens fokale utbredelse kan gi falskt negativ biopsi [24].

Sekvensering og vevsdiagnostikk

Målrettet sekvensering

Sekvensering brukes til:

• virusgenotype og subtype
• antiviral resistens
• utbruddsanalyse og smittekjeder
• påvisning av tap av diagnostisk mål
• identifisering av nye varianter
• karakterisering av uvanlige funn

Genotypisk resistensbestemmelse påviser kjente mutasjoner. Den kan ikke alltid forutsi fenotypen, særlig hvis mutasjonens kliniske betydning er uklar eller resistente varianter utgjør en liten andel av viruspopulasjonen. Resultatet må tolkes mot behandlingseksponering, virusmengde og etablerte resistensdatabaser.

Metagenomisk sekvensering

Metagenomisk neste generasjons sekvensering, mNGS, analyserer i prinsippet alt DNA og RNA i prøven uten at et spesifikt patogen må angis på forhånd. Metoden er mest nyttig ved alvorlig, uforklart infeksjon når målrettede analyser har vært negative, særlig i normalt sterile prøver.

Fordeler:

• bred agensdeteksjon i én enkelt prøve
• mulighet for å identifisere uventede eller nye virus
• mindre avhengig av dyrkbarhet
• kan samtidig gi typingsinformasjon

Begrensninger:

• lav mengde viralt materiale kan skjules av humant DNA
• RNA-virus krever tilpasset prøveforberedelse
• kontaminasjon og normalflora kan gi funn som er vanskelige å tolke
• rapporteringsterskler er ikke standardiserte
• et negativt svar utelukker ikke infeksjon
• krever bioinformatikk og klinisk ekspertvurdering

NGS brukes klinisk som helgenomsekvensering, målrettet metagenomikk eller bred metagenomikk. Bred metagenomikk kan identifisere virus, bakterier, sopp og parasitter direkte fra prøven, men vertens nukleinsyre og den normale mikrobiotaen reduserer følsomheten [25]. I en metaanalyse av 20 studier var samlet følsomhet 75 prosent og spesifisitet 68 prosent, med svært stor heterogenitet [26].

I en prospektiv multisenterstudie av 204 pasienter med meningitt eller encefalitt ble det diagnostisert 58 infeksjoner. mNGS identifiserte 13 infeksjoner som ikke var funnet ved det lokale sykehusets konvensjonelle testing, men overså blant annet infeksjoner som bare kunne diagnostiseres serologisk, fra annet vev eller ved svært lav patogenmengde i spinalvæske [27]. mNGS bør derfor supplere, ikke erstatte, målrettet PCR, serologi og prøve fra relevant vev.

Immunhistokjemi og in situ-hybridisering

Immunhistokjemi lokaliserer viralt antigen i vev. In situ-hybridisering lokaliserer viral nukleinsyre til spesifikke celler. Disse metodene er særlig verdifulle når kausalitet krever at viruset vises i den skadde eller neoplastiske cellepopulasjonen.

PCR på vev kan være mer følsom, men viser ikke hvilke celler som inneholder viruset. Formalinfiksering, iskemitid og autolyse kan forringe nukleinsyre og antigen. Elektronmikroskopi er tidkrevende og innebærer risiko for morfologisk feiltolkning. I sammenlignende vevsstudier av SARS-CoV-2 har RNA-baserte metoder vært mer robuste enn immunhistokjemi, mens in situ-hybridisering har gitt mulighet for cellulær lokalisering [12].

Praktisk resultattolkning

Sannsynlighet før og etter test

Positiv og negativ prediktiv verdi påvirkes av prevalens og klinisk sannsynlighet. Ved lav sannsynlighet kan en liten falskt positiv andel gi flere falske enn sanne positive resultater. Ved høy sannsynlighet kan en negativ test være utilstrekkelig for å utelukke infeksjon.

Eksempel: hvis en analyse har 99 prosents spesifisitet og brukes hos 1 000 personer der bare én virkelig er infisert, kan det oppstå omkring ti falskt positive resultater for hvert sant positive resultat. Samme test får en betydelig høyere positiv prediktiv verdi under et utbrudd [15].

Diskrepante resultater

Ved diskrepans mellom klinikk og laboratorium:

1. verifiser pasientidentitet, prøvetidspunkt og prøvemateriale
2. kontroller sykdomsfase og tidligere behandling
3. vurder om funnet kan skyldes vaksinasjon eller tidligere infeksjon
4. spør laboratoriet om signalstyrke, grenseverdi og interne kontroller
5. vurder kontaminasjon, kryssreaksjon eller sekvensvariasjon
6. ta prøven om igjen fra samme eller bedre lokalisasjon
7. bruk en metode med et annet prinsipp eller en annen målsekvens
8. vurder alternative infeksiøse og ikke-infeksiøse diagnoser

Et laboratoriefunn bør veie tyngst når det biologisk besvarer det kliniske spørsmålet. Direktepåvisning fra sykt vev er vanligvis sterkere støtte for kausalitet enn seropositivitet i blod. Serokonversjon er sterkere støtte for nylig infeksjon enn isolert IgM. En reproduserbar kvantitativ trend er mer informativ enn en enkeltstående lav positiv verdi.

Kvalitetssikring og svarkommunikasjon

Laboratoriet skal validere analysen for angitt prøvemateriale og bruksområde. Kvalitetssikring omfatter positive, negative og interne kontroller, tiltak mot kontaminasjon, deltakelse i ekstern kvalitetskontroll og overvåking av sekvensvariasjon som kan påvirke diagnostiske mål.

Et nyttig svar bør, når det er relevant, angi:

• virus og eventuell type
• påvist, ikke påvist eller grenseverdi
• prøvemateriale
• kvantitativt nivå og enhet
• deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense
• om resultatet ligger utenfor lineært måleområde
• om analysen er validert for den aktuelle prøvetypen
• viktige tolkningsbegrensninger
• anbefaling om ny prøve eller konfirmasjon

Klinikeren bør på rekvisisjonen angi symptomdebut, eksponering, reise, vaksinasjon, graviditet, immunstatus, transplantasjon, antiviral behandling og relevant syndrom. Disse opplysningene kan påvirke både valg av analyse og hvordan laboratoriet vurderer et uventet resultat.

Kilder

1. Tang YW et al. Laboratory Diagnosis of COVID-19: Current Issues and Challenges. Journal of Clinical Microbiology 2020. PMID: 32245835
2. Davenport C et al. The effect of sample site and collection procedure on identification of SARS-CoV-2 infection. Cochrane Database of Systematic Reviews 2024. PMID: 39679851
3. Safiabadi Tali SH et al. Tools and Techniques for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 SARS-CoV-2/COVID-19 Detection. Clinical Microbiology Reviews 2021. PMID: 33980687
4. LeGoff J et al. Diagnosis of genital herpes simplex virus infection in the clinical laboratory. Virology Journal 2014. PMID: 24885431
5. Arevalo-Rodriguez I et al. Laboratory-based molecular test alternatives to RT-PCR for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection. Cochrane Database of Systematic Reviews 2024. PMID: 39400904
6. Kim DK, Poudel B. Tools to detect influenza virus. Yonsei Medical Journal 2013. PMID: 23549796
7. Hermos CR et al. Human metapneumovirus. Clinics in Laboratory Medicine 2010. PMID: 20513544
8. Prasidthrathsint K, Stapleton JT. Laboratory Diagnosis and Monitoring of Viral Hepatitis. Gastroenterology Clinics of North America 2019. PMID: 31046974
9. Punchoo R et al. Laboratory Considerations for Reporting Cycle Threshold Value in COVID-19. EJIFCC 2022. PMID: 36313906
10. Fragkou PC et al. Performance of point-of care molecular and antigen-based tests for SARS-CoV-2: a living systematic review and meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection 2023. PMID: 36336237
11. Hayden MK et al. The Infectious Diseases Society of America Guidelines on the Diagnosis of COVID-19: Antigen Testing. Clinical Infectious Diseases 2024. PMID: 36702617
12. von Stillfried S, Boor P. Detection methods for SARS-CoV-2 in tissue. Der Pathologe 2021. PMID: 33770236
13. Huber T et al. Diagnostic performance of four SARS-CoV-2 antibody assays in patients with COVID-19 or with bacterial and non-SARS-CoV-2 viral respiratory infections. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2021. PMID: 34109500
14. De Paschale M, Clerici P. Serological diagnosis of Epstein-Barr virus infection: Problems and solutions. World Journal of Virology 2012. PMID: 24175209
15. Musso D, Despres P. Serological Diagnosis of Flavivirus-Associated Human Infections. Diagnostics 2020. PMID: 32423058
16. Piantadosi A, Kanjilal S. Diagnostic Approach for Arboviral Infections in the United States. Journal of Clinical Microbiology 2020. PMID: 32938736
17. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. Journal of Molecular Diagnostics 2008. PMID: 18556771
18. Boivin G. Diagnosis of herpesvirus infections of the central nervous system. Herpes 2004. PMID: 15319090
19. Lipkin WI, Hornig M. Diagnostics and Discovery in Viral Central Nervous System Infections. Brain Pathology 2015. PMID: 26276023
20. Mak JWY et al. Prevention and management of hepatitis B virus reactivation in patients with hematological malignancies in the targeted therapy era. World Journal of Gastroenterology 2023. PMID: 37731995
21. Williams E et al. Laboratory diagnosis of HIV: a contemporary overview in the Australian context. Pathology 2023. PMID: 37302942
22. Bolduc P et al. Care of Patients With HIV Infection: Diagnosis and Monitoring. FP Essentials 2016. PMID: 27092562
23. Gaur P et al. Is it not time for international guidelines to combat congenital cytomegalovirus infection? A review of central nervous system manifestations. Clinical Radiology 2020. PMID: 32216960
24. Al-Talib M et al. BK Polyomavirus-associated nephropathy: diagnostic and treatment standard. Nephrology Dialysis Transplantation 2025. PMID: 39794277
25. Hilt EE, Ferrieri P. Next Generation and Other Sequencing Technologies in Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases. Genes 2022. PMID: 36140733
26. Liu J et al. Diagnostic accuracy of metagenomic next-generation sequencing in diagnosing infectious diseases: a meta-analysis. Scientific Reports 2022. PMID: 36470909
27. Wilson MR et al. Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. New England Journal of Medicine 2019. PMID: 31189036